Generación de células funcionales similares a colangiocitos a partir de células madre pluripotentes humanas y células HepaRG

Los colangiocitos son células epiteliales biliares que, al igual que los hepatocitos, se originan en los hepatoblastos durante el desarrollo embrionario.

Tipo de Stem Cell: Células madre embrionarias (pluripotentes) humanas (hESC) y células HepaRG.

Método de obtención: En días 10-12 de diferenciación se recogieron los hepatoblastos de hESC / hiPSC con tampón de disociación celular  y se sembraron en placas recubiertas con colágeno I de 12 pocillos (BD Biosciences) con medio de recubrimiento durante 4 horas, finalmente se incubaron tales células con medio de diferenciación biliar.

Vía de administración: No especifica.

Resultados:

-Corto plazo: Las células expresaron marcadores de pluripotencia incluyendo OCT4, NANOG, TRA ‐ 1‐60 y SSEA4 y fueron negativos para GATA4, confirmando la ausencia de diferenciación endodérmica

-Mediano plazo: Desarrollado inicialmente para hESC que puede usarse para generar células similares a colangiocitos a partir de hiPSC y de células HepaRG.

-Largo plazo: Colangiocitos generados por este enfoque pueden representar un modelo útil para desarrollo de estrategias terapéuticas.

La función fisiológica principal de los colangiocitos es regular activamente la composición de la bilis mediante la modificación de los componentes de la bilis derivados de los hepatocitos a través de una serie de eventos secretores y reabsorbentes.

Referencias:

Combettes D. Generación de células funcionales tipo colangiocito a partir de células madre pluripotentes humanas y células HepaRG. [Internet]. 2015 [Citado 28 Diciembre 2019] Disponible en: https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/hep.27165

Colecistitis embrionaria y contracción defectuosa de la vesícula biliar en el modelo de ratón transgénico con atresia biliar con sox17 insuficiente.

En este estudio, los análisis transcriptómicos revelaron el inicio temprano de la colecistitis en embriones Sox17 ^+/- , junto con la aparición de epitelios similares a los conductos quísticos ectópicos en sus vesículas. La hepatitis embrionaria mostró correlaciones positivas con la gravedad de la colecistitis en embriones Sox17 ^+/- individuales.

Análisis: 

Organismo transgénico: Embrión de ratones transgénicos de fenotipo ALB- cre / sox17 flox / flox  y Pdx1- cre / sox17 flox / flox (Knock-In).

Métodos de obtención: Se obtuvieron de tipo salvaje hembras (C57BL6 [B6] cepa; Clea Japan) acoplado con el sox17 +/- ratones macho (Kanai-Azuma et al., 2002) que se entrecruzan y se mantuvo a F8-F9 retrocruzamiento generación a la cepa B6 además se realizó la inmunohistoquímica (IHC) por el protocolo estándar e in situ hibridación se realizó como se describe por  Hiramatsu et al. (2009)

La vesícula biliar Sox17 ^+/- también mostró una reducción drástica en la expresión sónica del erizo, lo que condujo a una formación aberrante de músculo liso y una contracción defectuosa de la vesícula fetal. La contracción defectuosa de la vesícula biliar se correlacionó positivamente con la gravedad de la hepatitis embrionaria en embriones Sox17 ^+/- , lo que sugiere una posible contribución de la colecistitis embrionaria y la contracción de la vesícula fetal en la patogenia temprana de la atresia biliar congénita.

Transgénicos:

Ventajas:

• Aumentar la producción de alimentos. 
• Posibilidad de solucionar el hambre en el mundo. 
• Se puede modificar para mejorar la salud.

Desventajas: 

• Posibles efectos negativos en a salud a largo plazo. 
• Posible relación con el desarrollo de enfermedades. 
• Invasión de ecosistemas.

Referencias:

1. Higashiyama , Ozawa , Sumitomo , Uemura , Fujino , Igarashi , et al. NCBI- Pubmed. [Online].; 2017 [cited 2019 diciembre 19. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28432216.

2. Arriols E. Ecología verde. [Online].; Actualizado el 27 de agosto del 2019 [cited 2019 Diciembre 19. Available from: https://www.ecologiaverde.com/ventajas-y-desventajas-de-los-alimentos-transgenicos-1073.html#anchor_2.

Fragmentación de gallbladder stones con transformador streptococcus salivarius y medición de la expresión de arn al colesterol Genes inferiores

Objetivo (O): Diagnosticar la expresión de ciertos genes en Streptococcus salivarus y posterior a ello dar un tratamiento para lograr reducir la concentración de cálculos biliares.

Genes (G): Genes de Streptococcus Salivarus gen bsh y gen cgh.

Enzimas de restricción (EZ): Sin específicar

Enzima ligasa (EL): Sin específicar

Vector (V): pMG36 bsh

Célula receptora (CR): Streptococcus Salivarus

Método de transferencia del gen (MTG): Transformación

Método de identificación de clones (MIC): Cultivo, PCR, Prueba de sensibilización a antibioticos, easy-spinTM, total RNA extraction kit and PCR cDNA-RT.

Referencias: 

Majeed, Atheer. (2017). Fragmentation of gallbladder stones using transformer streptococcus salivarius and measuring of RNA expression to cholesterol lowering genes. Pakistan Journal of Biotechnology. 14. 745-751. Disponible en: 

https://www.researchgate.net/publication/328319757_Fragmentation_of_gallbladder_stones_using_transformer_streptococcus_salivarius_and_measuring_of_RNA_expression_to_cholesterol_lowering_genes

Ejemplo de Recombinación de ácidos nucléicos que suceden en la naturaleza

El ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente, de esta manera podemos hacer que un organismo animal, vegetal, bacteria, hongo o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.

En cuanto a la modificación genética, se crea a través de la introducción de ADN pertinentes en un ADN existente de organismos, tales como los plásmidos de las bacterias, para codificar o alterar las características diferentes para un propósito específico, tales como resistencia a los antibióticos.

Se diferencia de la recombinación genética en los que no se produce a través de procesos naturales dentro de la célula, pero está diseñado. Entre los ejemplos tenemos a los bacteriófagos, plásmidos, cósmidos.

Plásmidos: son secuencias de ADN extra cromosómicas que tienen la capacidad de reproducirse autónomamente y, algunos, de pasar de una célula a otra y convertirse en parte integrante del cromosoma que los acoge. Los plásmidos llevan consigo genes en grado de conferir particularidades fenotípicas a las bacterias que los contienen, como la resistencia a los antibióticos.

Referencias Bibliográficas: 

1.	Alonso L. Investigación y Ciencia. [Online].; 2016 [cited 2019 diciembre 8. Available from: https://www.investigacionyciencia.es/revistas/investigacion-y-ciencia/nacido-del-caos-674/adn-recombinante-14328.

2. Video obtenido de: https://www.youtube.com/watch?v=aa4vmP4JXM0
3. Imagen obtenida de: https://cdn.kastatic.org/ka-perseus-images/06b51ad86868249a9d88a907d1b3d07a563613cf.png 

Metilación del área promotora de CDKN2A en los cánceres de la vesícula biliar detectados por metilación específica mediante PCR

Modificación del ADN con bisulfito y test de metilación específica mediante PCR (MSP). El principio de la modificación de ADN con la técnica de bisulfito de sodio se basa en su capacidad de convertir a todos los residuos de citosina (C) no metiladas en uracilos (U), mediante deaminación, pero cuando la citosina está metilada es resistente a la reacción y permanece como citosina. Los iniciadores de PCR descritos por Herman et  aprovechan estas diferencias para discriminar entre aquellas frecuencias metiladas y no metiladas (Figura 2). Uno de los iniciadores de cada par fue marcado con g-ATP con polinucleótido-kinasa (PNK). Las mezclas de PCR contenían 100 nm de cada primer, 200 mM de cada dinucleótido y una concentración de magnesio de 1,5 mM. Las temperaturas óptimas de hibridación fueron de 60°C y 63°C para los iniciadores que detectaban el ADN no metilado y metilado, respectivamente. Las amplificaciones se realizaron mediante 40 ciclos.

Inactivación del gen CDKN2A: La amplificación del ADN tumoral por los iniciadores específicos para las secuencias metiladas fue detectada en 24% de los 38 cánceres de vesícula biliar produciendo una banda de 150 pb (Figura 2). El desbalance alélico en uno o más marcadores microsatelitales fue detectado en 11% de los 38 tumores de vesícula biliar.

Nuestros resultados mostraron una tendencia no significativa de peor pronóstico en el grupo de pacientes con inactivación del gen CDKN2A (p=0,09) este hecho concuerda con estudios en tumores de vesícula biliar y de otros órganos.

 Referencia: 

Antigua: BMC [Internet] ARN largo no codificante. 2019 [citado el 23 de noviembre del 2019] Disponible en: https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-019-1237-5

Actual: 

Roa S Juan Carlos, Vo Quynh, Araya O Juan Carlos, Villaseca H Miguel, Guzmán G Pablo, Ibacache S Gilda et al . Inactivation of CDKN2A gene (p16) in gallbladder carcinoma. Rev. méd. Chile  [Internet]. 2004  Nov [citado  2019  Dic  10] ;  132( 11 ): 1369-1376. Disponible en:https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?pid=S0034-98872004001100005&script=sci_arttext&tlng=en

Análisis mediante Microarray de la expresión de la proteína 1 de la familia del factor trébol (TFF1, pS2) en la colecistitis crónica y el carcinoma de vesícula biliar.

Investigamos la expresión de TFF1 en la mucosa de la vesícula biliar no neoplásica sana e inflamada, así como en los carcinomas de vesícula biliar (n = 57) y las metástasis correspondientes (n = 18), utilizando un microarray de tejidostécnica.

La inmunoreactividad de TFF1 estuvo ausente en la mucosa sana, se observó focalmente en el epitelio con cambios inflamatorios y se presentó en el 35% de los tejidos de cáncer primario y el 24% de los metastásicos. La inmunoreactividad disminuyó significativamente al aumentar el estadio tumoral (P = 0.009) y al aumentar el grado del tumor (P = 0.001). Los pacientes con tumores positivos para TFF1 mostraron un resultado más favorable en comparación con los pacientes con tumores negativos para TFF1 en el análisis univariado (P = 0,006).

En conclusión, TFF1 se expresa en el epitelio de la vesícula biliar no neoplásico inflamado y en los carcinomas de estadio bajo y de bajo grado. Por lo tanto, TFF1 puede ser el eslabón perdido entre los cálculos biliares, la colecistitis crónica y cáncer de vesícula biliar. 

Referencias Bibliográficas: 
1. Peter K, Peter R, Martina L, Margit GK, Cord L. Pubmed. [Online].; 2005 [cited 2019 noviembre 23. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15821928.

2. Vídeo obtenido de: https://www.youtube.com/watch?time_continue=1&v=ePFE7yg7LvM&feature=emb_logo

Prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa en la Colelitiasis

PCR-MULTIPLEX

TEMA: Efecto protector de α- talasemia en la colecistitis y la colecistectomía en la enfermedad de células falciformes

OBJETIVO: Conocer el papel protector de las deleciones de genes individuales de α- talasemia en la aparición de colelitiasis y colecistitis en pacientes de SCD, para correcto diagnóstico y tratamiento.

MUESTRA: Muestras de sangre periférica de 102 pacientes ambulatorios SCD (47% hombres y 53% mujeres).

TIPOS DE ADN: ADN genómico de muestras de sangre periférica.

GENES A AMPLIFICAR CON EL TAMAÑO EN PARES DE BASES: Genes individuales α-thal comunes -α 3,7 (2022/2029 pb); -α 4,2 (1628 pb) y el gen α 2 (1800 pb).

EXTRACCIÓN DEL ADN: 
El ADN genómico se aisló de sangre periférica. Leucocitos con Biopur Kit Mini Spin Plus (Biometrix® Diagnostic, Curitiba, Brasil) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además, la muestra de ADN se cuantificó en NanoDrop ® (Thermo Scientific, EE. UU.).

PCR MULTIPLEX: 
-Desnaturalización: 95 ° C durante 5 min.

-Hibridación: 30 ciclos de hibridación (98 ° C durante 45 s, 63 ° C durante 90 s y 72 ° C durante 135 s).

-Elongación: 72 ° C durante 5 min.

MÉTODOS: El genotipo de α-globina se determinó en 83 pacientes con SCD utilizando la reacción en cadena de la polimerasa múltiple y se comparó con los eventos clínicos.

VISUALIZACIÓN: Electroforesis 15 μl de producto a través de un gel de agarosa al 1% en 1X TBE durante 1 hora.

SENSIBILIDAD y ESPECIFICIDAD: 

La presencia de cálculos biliares pigmentadas con diagnóstico fue confirmado por ultrasonografía (USG) ( n = 77/83) y / o por la colecistectomía ( norte= 38/83). Además, la presencia de dolor abdominal aguda recurrente asociada con colelitiasis se registró como la colelitiasis sintomática (26/38). (2) colecistitis: Cualquier episodio de dolor abdominal en el  cuadrante superior derecho con fiebre o Murphy positivo cuadrante superior derecho con fiebre o Murphy positivo cuadrante superior derecho con fiebre o Murphy positivo cuadrante superior derecho con fiebre o Murphy positivo cuadrante superior derecho con fiebre Murphy positivo cuadrante superior derecho con fiebre o Murphy positivo =21/38) requirieron hospitalización. (3) secuestro esplénico agudo (CULO): Cualquier registro de CULO y / o esplenectomía. (4) La hidroxiurea (HU): el uso de la terapia con medicamentos es para un período mínimo de 12 meses ( n = 61/83 pacientes)

Referencias Bibliográficas:
1. Pontes RM, Costa ES, Siqueira PFR, Medeiros JFF, Soares A, de Mello F V., et al. Protector effect of α-thalassaemia on cholecystitis and cholecystectomy in sickle cell disease. Hematology. 2017;22(7):444–9. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28220719

2. Vídeo obtenido de: https://www.youtube.com/watch?v=DZ7yHQAJBnw&feature=emb_logo

Prueba de Tamizaje y una confirmatoria para colelitiasis

Prueba de Tamizaje

Se recomienda realizar la investigación de factores de riesgo en mujeres

asintomáticas en torno a los 40 años de edad. Esta evaluación se podría realizar

durante el examen de medicina preventiva del adulto recomendado por el

Ministerio de Salud.

Los factores de riesgo a evaluar son:

• Multiparidad
• Índice de masa corporal IMC >25
• Nivel educacional < 8 años
• Ascendencia mapuche (al menos 1 apellido

Prueba confirmatoria

Se procederá a solicitar ecotomografía abdominal priorizada a:

1.  Las mujeres asintomáticas con factores de riesgo demostrados
2.  Población sintomática de ambos sexos entre 35 y 49 años (se considera equivalente a la existencia de síntomas actuales, el antecedente de cólico biliar previo, colecistitis crónica no operada, o una ecotomografía abdominal previa compatible con colelitiasis).
3. Población de ambos sexos con antecedente de cólico biliar previo, colecistitis crónica no operada, o una ecotomografía abdominal previa compatible con colelitiasis, de ambos sexos y toda edad.

Referencias:

GUIAS CHILENA Colesistectomia-preventiva-CA VESICULA. 2014;[Citado el 27 de octubre del 2019] Disponible en: http://www.bibliotecaminsal.cl/wp/wp-content/uploads/2016/04/Colesistectomia-preventiva-adultos.pdf

Alteraciones de la Epigenómica en la Colelitiasis-Análisis mediante Western Blot

Aplocación de Western Blot para detectar la manifestación inusual de Live Staphylococcus saprophyticus, Corynebacterium urinapleomorphum, y Helicobacter pylori en la vesícula biliar con colecistitis.

Las muestras bacterianas se resolvieron en 6% y 8% en geles de SDS-PAGE, seguido de transferencia Western utilizando el método de transferencia semiseca. anticuerpos anti-CagA monoclonales de ratón se adquirieron de Austral-Biológica.

Estos anticuerpos se generaron, purificarse y prepararse usando estándar protocolos del fabricante (biogénicos GmbH, Berlín, Alemania). inmunoglobulinas de cabra polivalente anti-conejo o anti-ratón acoplados a peroxidasa de rábano picante se utilizaron como anticuerpos secundarios (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Las inmunotransferencias se desarrollaron usando el kit de Western blot ECL Plus (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido)

La posible contribución de S. saprophyticus,  C. urinapleomorphum, y H. pylori  a la vesícula biliar patología todavía no está claro y  por lo tanto es necesario investigar si este entorno puede representar un depósito para la supervivencia y el crecimiento que podría servir como una fuente potencial para la transmisión bacteriana más estudios. 

En este caso, es notable que el tratamiento antibiótico erradicada H. pylori desde el estómago, pero no de la vesícula biliar.

Referencias: 
Antigua: Menéndez-Sánchez P, León-Salinas C, Amo-Salas M, Méndez-Cea B, García-Carranza A. Asociación de parámetros analíticos y radiológicos en el diagnóstico de la colecistitis aguda. Rev Gastroenterol Mex [Internet]. 2019;84(4):449–54. [Citado el 3 de noviembre del 2019]

Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037509061830171X?via%3Dihub
Actual: S B. Pubmed. [Online].; 2018 [cited 2019 diciembre 13. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6073424/figure/ijms-19-01826-f001/.
Imagen tomada de: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/93/Western_blot_transfer.png/750px-Western_blot_transfer.png 

Alteraciones de la traducción en la Colelitiasis

Aunque los informes varían ligeramente, generalmente se acepta que al menos nueve genes MUC se expresan en la vesícula biliar y / o sus enfermedades asociadas. Todavía hay cierto desacuerdo sobre cuál es el principal MUC de la vesícula biliar. El ARNm de MUC3 y MUC5B también estaba regulado por incremento en esos grupos. 

Los genes de mucina con los niveles de expresión más altos en el tejido de la vesícula biliar en las enfermedades asociadas al colesterol fueron MUC3 y MUC5B. Los cálculos de colesterol y las infecciones de la vesícula biliar se asociaron con una mayor expresión de MUC3 y MUC5B.

Referencias: 

NCBI[Internet]Expresión de MUC en tejidos epiteliales de vesícula biliar [Citado el 27 de octubre del 2019] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5003211/

Alteraciones de la Transcripción en la Colelitiasis

El factor 1 inducible por hipoxia (HIF1) es un factor de transcripción importante para regular la expresión de los genes implicados en el suministro de oxígeno, el crecimiento celular y la homeostasis redox, facilitando respuestas adaptativas a las condiciones hipóxicas y la activación de la vía HIF1A en el hígado esteatótico inducido por la dieta acelera la formación de cálculos biliares en ratones de tipo salvaje. Lo que sugiere que el HIF1A hepático puede desempeñar un papel vital en la formación de cálculos de colesterol en pacientes con NAFLD.

Referencia:

NCBI[Internet]Modelos de ratón de la enfermedad de cálculos biliares, 2018 [Citado el 20 de octubre del 2019] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5938553/

Alteraciones genómicas en la Colelitiasis

Los transportadores y sus reguladores genéticos están implicados en la fisiopatología de numerosas enfermedades, como por ejemplo la Colelitiasis.
Las alteraciones genómicas ocasionan:

MDR3: Desarrollo de colestasis intrahepática del embarazo.

ABCG5/8:  La sitosterolemia, este desajuste se produce porque los ABCG5/8 permiten altas tasas de absorción intestinal de esteroles, pero impiden su secreción biliar, produciéndose una retención hepática.

ASBT y NTCP: Reduciendo la cantidad de sales biliares para secretar a vesícula biliar e incrementando el riesgo a desarrollar cálculos biliares.

Referencias:
Castro I, Martínez M. Transportadores de lípidos biliares: una revisión actualizada. Gen  [Internet]. 2013  Mar [citado  2019  Oct  12] ;  67( 1 ): 49-57. Disponible en: http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid=S0016-35032013000100012&script=sci_arttext

Colelitiasis

¿Qué es?

La colelitiasis o litiasis biliar es una enfermedad que se caracteriza por la presencia de cálculos en el interior de la vesícula biliar. Es una de las patologías más frecuentes en aparato digestivo, presentando una mayor prevalencia a edades más avanzadas y en la mujer con una proporción 2:1.

https://www.youtube.com/watch?v=xEwcFrr4zXM
Referencia:
Mas MV, Valenzuela JE. Science Direct. [Internet].; 2008 [citado 2019 octubre 1. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0211344908731047

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